La Capilla Mayor es la construcción más antigua de la Catedral, restaurada en el año 1488 por el Cardenal Mendoza, al levantar las bóvedas y los muros del ábside medieval. Tras una reja de 1633 donada por fray Pedro de Mendoza, obra de Domingo de Zialceta, se entra en un espacioso presbiterio que guarda excelentes obras de arte.

A ambos lados flanqueando la entrada, se hallan dos extraordinarios púlpitos de alabastro: el de la Epístola y el del Evangelio. El primero, gótico, se construyó en 1495 por deseo del Cardenal Mendoza. El segundo, plateresco, fue labrado por Martín de Vandoma entre 1572 y 1573. Ya en el interior, podemos contemplar varios sepulcros góticos: el de don Pedro de Leucata (s. XII), el de fray Alonso Pérez de Zamora (s. XIV), el de don Alonso Carillo de Albornoz, Cardenal de San Eustaquio, el de María de Castilla (nieta de Pedro el Cruel) y el de su esposo Gómez Carrillo de Acuña.

La gran obra de la Capilla Mayor es el retablo de madera policromada, realizado por el escultor Giraldo de Merlo y encargado por el obispo Mateo de Burgos. Es de estilo manierista y se ejecutó entre 1609 y 1611. El retablo consta de un zócalo y tres cuerpos de distinto orden: jónico, corintio y compuesto, con imágenes relativas a la vida de Jesús y advocaciones de distintos santos que sirven para enmarcar la Asunción de la Virgen, patrona titular de la Catedral.